解新明¹ 张寿洲² 李勇² 吴鸿¹ 李秉滔¹

（1.华南农业大学植物研究室，广州 510642；2. 深圳仙湖植物园，深圳 518004）

摘要 研究了梧桐科9族11属植物核糖体DNA的内转录间隔区ITS序列（包括ITS1、ITS2和5.8s rRNA基因）。结果表明，梧桐科不是一个单系群，这与传统的认识相吻合。从依据ITS序列资料所建立的分支图来看，这9个族被分成4支，一支仅包括Fremontineae，它与锦葵科有最近的亲缘关系；一支包括 Dombeyeae 和 Pterospermeae，表明Pterospermum与 Dombeyeae有更近的亲缘关系，因而支持将Pterospermum从Helictereteae分离出来另立为族的观点；一支包括Hermannieae, Tarrietieae, Helictereteae, Theobromeae, Byttnerieae和Sterculieae的Firmiana，这一支构成了梧桐科的核心分支；最后一支仅包括Sterculieae 1个族, 它是梧桐科进化的主干线，是连接较低等科与较进化科的中心纽带。

关键词 梧桐科；ITS；系统学意义

XIE Xin-Ming¹ ZHANG Shou-Zhou² LI Yong² WU Hong¹ LI Bing-Tao¹

1. Institute of Botany, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 2. Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden, Shenzhen 518004, China)

Abstract A molecular phylogeny of the family Sterculiaceae represented by eleven genera of nine tribes was constructed using sequences analysis of the internal transcribed spacers (ITS) (including ITS1, ITS2 and 5.8s rRNA gene) of nuclear ribosomal DNA. Direct PCR sequencing method was used in the study. The results showed that Sterculiaceae was not a monophyletic group, and the following relationships were supported: (1) a clade containing only Fremontineae, which had a closer relationship with Malvaceae; (2) a clade containing Dombeyeae and Pterospermeae, which indicated that Pterospermum had a closer relationship with Dombeyeae than with Helictereteae, supporting the classification treatment of separating Pterospermum from Helictereteae as an independent tribe; (3) a clade consisting of Hermannieae, Tarrietieae, Helictereteae, Theobromeae, Byttnerieae, plus Firmiana of Sterculieae, which constituted a core clade of Sterculiaceae; (4) a clade containing only Sterculieae, which was an evolutionary main-line of Sterculiaceae from primitive families to advanced ones.

Key words Sterculiaceae; ITS; Systematic implication

   梧桐科Sterculiaceae是锦葵目中的一个多型科，共60属1546种（徐颂军，徐祥浩，2001）。由于该科植物的花部形态特征较为多样化，生活习性复杂，并广泛分布于世界热带和亚热带地区，以至长期以来对于该科的分类地位和系统发育关系以及科下等级的分类地位和亲缘关系的确立一直没有在各国学者间达成共识（徐颂军，徐祥浩，2000；徐祥浩，1977，1984； Bayer et al.,1999；Alverson et al.，1999 ；Willis，1973；Hutchinson，1967）。虽然梧桐科在锦葵目中的分类地位是稳定的，但由于锦葵目具有广义和狭义的两种概念，这就给梧桐科亲缘关系的确立带来一些不确定性。就梧桐科的科下等级而言，由于梧桐科与椴树科Tiliaceae、木棉科Bombacaceae和锦葵科Malvaceae之间紧密的亲缘关系，致使田麻属Corchoropsis、滇桐属Craigia、平当树属Paradombeya、Chiranthodendron、Fremontodendron、午时花属Pentapetes、梅蓝属Melhania等属动荡于这些科间，或者在梧桐科内的分类地位受到怀疑（徐颂军，徐祥浩，2000; 唐亚，1992a，1992b；龙活等，1985；诸葛仁，1984；Tang, 1993; Willis，1973；Hutchionson，1967；）。同样，翅子树属Pterospermum曾被置于山芝麻族Helictereteae（Schulze-Motel，1964），后唐亚（Tang,1992c）将其从山芝麻族中分出，单独建立了翅子树族（Pterospermeae）。然而，Bayer等（1999）和Alverson等（1999）却对此表示怀疑，认为Pterospermum有种子翅与Helmiopsideae族的Helmiopsis和Helmiopsiella相同，并与该族一起列入了他们所建立的非洲芙蓉亚科Dombeyoideae中。

   随着现代生物技术的不断发展，DNA序列资料的证据也被用于梧桐科的分类学研究中。Alverson等（1999）和Bayer 等（1999）分别依据ndhF、atpB和rbcL的序列资料对核心锦葵目进行了重新界定，并建议将核心锦葵目的4个科合并为1个科，原传统的梧桐科被分成了4个亚科分散在其中。由此可以看出关于梧桐科的系统及分类学研究的确存在极大的争议。考虑到叶绿体基因是单亲遗传的，在揭示网状进化事件方面具有很大的局限性（汪小全，李振宇，1998），我们选择了核DNA的ITS序列作为研究对象对梧桐科9族11属的代表类群进行了序列分析，试图为梧桐科的系统发育研究和翅子树族系统分类地位的确立提供佐证。

  本研究所用材料来源于两种途径，一是来源于华南植物园和深圳仙湖植物园并进行测序；二是来源于GenBank已有序列，共9族11属另加1个锦葵科外类群朱槿（Hibiscus rosa-sinensis），详见表1。

   硅胶干燥叶片或新鲜叶片总DNA提取采用CTAB法（Doyle 和Doyle，1987），扩增使用引物序列为ITS1（5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’）和ITS2（5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’）。扩增反应在Eppendof公司Mastercycler Gradient PCR仪上进行，反应体积为25μL，内含1×buffer， MgCl₂ 2mmol/L，dNTP各100 μmol/L，Taq DNA聚合酶（大连宝生物公司）1U，引物浓度0.2nmol/L，总DNA模板20-50ng。扩增反应程序为94℃预变性3min，然后94℃30s→50℃40s→72℃50s，进行35个循环，最后72℃延伸7min。PCR产物使用上海生工的UNIQ-柱式DNA胶回收试剂盒进行纯化，纯化后的产物按照BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction试剂盒进行测序反应。测序反应体积为10μL，内含BigDye 1.5μL，引物1μL（3.2pmol），PCR回收纯化产物10-40ng，ddH₂O补齐10μL。测序反应程序为：98℃2min，94℃15sec→53℃8sec→60℃4min进行25个循环。测序反应所用引物为ITS1和ITS2，即对正反链进行双向测定。测序反应产物经沉淀、洗涤后直接在3100 GENETIC ANALYZAR自动测序仪（PE Applied Biosystem Inc.）上进行。测序资料已在GenBank注册（序列号为AY083654-AY083663）。

1.3 序列数据的处理

根据GenBank已有梧桐科ITS序列（Blattner，2001），确定核糖体DNA ITS1、ITS2及5.8s3个编码区的界限，以ClustalW（Higgins，1994）进行排序，然后用PAUP4.0b（Swofford，1998）软件进行系统发育分析。空隙处理作缺失（missing），外类群为锦葵科（H. rosa-sinensis）。分析时采用启发式搜索法（heuristic search），以最大简约法（MP）寻找最简约树，用bootstrap检验法（1000次重复）判断简约树中各分支的可信度。

表1 材料来源及GenBank序列号

Table 1 The sources of materials and their GenBank accession numbers

* The order of tribes according to Hutchinson’s treatment（Hutchinson, 1967）

2 结果分析

   本研究测定了9个类群（包括1个外类群）的整个ITS区（包括ITS1、5.8s和ITS2），其各片段的长度分别列入表2，并和GenBank中的Fremtondendron californicum、Abroma augusta和Hermannia incana相比较。从我们测序的结果来看，ITS1的长度范围为128-267，在整个ITS区，ITS1的长度变化最大，有3个种的长度在200bp以下；ITS2的长度范围为201-246，相差45bp，这比ITS1的长度变化要稳定的多；5.8s序列的长度最为保守，除Reevesia thyrsoidea（159bp）和Heritiera littoralis（159bp）外，其余种的长度均为162bp。用启发式搜索法寻找到1个最简约树，其树长为1477，一致性指数（CI）为0.6255，维持性指数（RI）为0.4561。图1为只显示bootstrap值大于50%的严格一致性树，可以看出梧桐科作为一个单系群的bootstrap值小于50%，充分反映了该科形态特征复杂多变的多型性特点。这与来自形态学及ndhF、rbcL和atpB序列分析的结果相吻合（徐颂军，徐祥浩，2000，2001；Alverson et al，1999；Bayer et al，1999）。从分支图的结构来看，梧桐科被分成4支，其中Fremontodendron单独构成一支，并显示了与锦葵科最近的亲缘关系；Dombeya和Pterospermum构成另外一支，并得到了89%的bootstrap值的支持；Hermannia、Firmiana、Heritiera、Reevesia、Abroma和Byttneria等6个属构成了梧桐科的核心分支，但这一支并没有得到bootstrap值（52%）的有力支持；第四支由Sterculieae族的Brachychiton和Scaphium构成，bootstrap值为100%，充分显示了二者同处一族的密切亲缘关系。

表2 梧桐科11种植物和外类群的ITS序列长度（bp）

Table 2 Lengths (bp) of ITS1, 5.8s rDNA and ITS2 of 11 species

in Sterculiaceae and outgroup

* 来源于GenBank。* From GenBank.a

   梧桐科是1830年所建立的科，在这之前该科植物一直被分散置于椴树科Tiliaceae与Malvaceae中（Jussieu，1789）。1830年以后，虽然大部分梧桐科植物有了稳定的归属，但仍有一些属动荡于锦葵科、椴树科及木棉科Bombacaeae之间（唐亚，1992a，1992b；诸葛仁，1989；龙活等，1985；徐祥浩，1977，1984；Tang，1993；Willis，1973；Hutchinson，1967；Edlin，1935）。鉴于这种情况，Alverson等（1999）和Bayer等（1999）分别依据ndhF、rbcL和atpB的序列资料对核心锦葵目（core Malvales）的4个科椴树科、梧桐科、木棉科和锦葵科进行了重新界定，根据分支图他们将这4 个科合并为1个科，即锦葵科，下属9个亚科，原梧桐科被分成4个亚科分散在其中。虽然来自ndhF和来自rbcL与atpB综合资料的证据都将梧桐科分成4个亚科，但一些族和属的归类在他们各自的分支图中仍有诸多不同。尽管我们不赞同这种以分支图为基础对锦葵目（包括锦葵科）进行全新归类的做法，但在他们的分支图中所揭示出的梧桐科各族之间的亲缘关系却具有重要的参考价值。从本文的分支图来看，与根据ndhF序列资料所建立的分支图有许多相似之处。首先是Fremontodendron，在ndhF的分支图中它被归入了传统的锦葵科中成为该科其他类群的姐妹群，而在本文的分支图中，它与锦葵科具有最近的共同祖先，显示了二者具有最近的亲缘关系。同时在Judd和Manchester（1997）的以形态学、解剖学、孢粉学和化学特征为基础的分支分析中，Fremontodendron也与锦葵科具有很近的亲缘关系。Fremontineae无花瓣和具合生雄蕊管等性状是梧桐科中的进化特征，这就使它成为了较低等的梧桐科与较高等的锦葵科之间的进化纽带（Judd and Manchester，1997；La Duke and Doebley，1995；Thorne, 1992; Dahlgren，1989； Takhtajan，1987； Cronquist, 1981，1988）。

   Pterospermum和Dombeya构成的分支得到了bootstrap值（89%）有力的支持，同样在依据ndhF资料所建立的分支图（Alverson et al，1999）中，其作为单系群的bootstrap值也为89%。从我们rbcL序列分析的结果（另文发表）来看，Pterospermum与Dombeya也同处一个分支，尽管其bootstrap值小于50%，但却显示了二者之间较近的亲缘关系。总之，这3方面分子资料的分析结果都证明Pterospermum和Dombeya有更近的系统发育关系，而与Helictereteae互为姐妹群。另外，二者花粉粒的表面纹饰都为刺状，与表面为网状、颗粒状或疣状的Helictereteae的花粉也明显不同（龙活等，1989；Erdtman，1952）。因此支持将Pterospermum从Helictereteae中分离出来另立为Pterospermeae的观点（Tang，1992c）。

   由Hermannia、Firmiana、Heritiera、Reevesia、Abroma和Byttneria所构成的分支是最有问题的一支（图1）。作为Hermannieae、Sterculieae、Tarrietieae、Helictereteae、Theobromeae和Byttnerieae等族的代表，这一分支与根据ndhF所建立的Byttnerioideae亚科（Alverson et al.，1999）有相似之处，所不同的是该亚科没有将Sterculieae和Tarrietieae这两个族包括其中。与我们依据rbcL资料所建立的分支图（另文发表）相比，Tarrietieae和Helictereteae又不在由Hermannieae、Sterculieae、Theobromeae、Byttnerieae和Lasiopetaleae等族所构成的分支中。然而，从本文的这个核心分支的亚分支来看，Sterculieae、Tarrietieae和Helictereteae却构成一支，虽然作为一个单系群的bootstrap值低于50%，但却反映了三者之间的内在联系。依据传统分类的观点（徐颂军，徐祥浩，2001；Hutchinson, 1967），Sterculieae、Tarrietieae和Helictereteae是梧桐科中最进化的类群，它们的共同特征是具有雌雄蕊柄，而且前两族还具有单被、单性等进化特征。此外，由于Heritiera的花粉在萌发孔的数目、形状、位置及网状的表面纹饰与Sterculieae有相同之处，Erdtman（1952）曾将它们共同作为Sterculieae型来处理。该核心分支的另一亚分支由代表Byttnerieae和Theobromeae两个族的Byttneria和Abroma构成，并得到了bootstrap值100%的支持。从形态特征来看，它们的花丝合生成管状，可育雄蕊与花瓣对生，退化雄蕊与花瓣交互对生，且都具有勺状花瓣（Alverson et al.，1999）。另外，根据Erdtman（1952）的分析，Byttneria和Abroma的花粉也同属一个类型，即花粉球形、3孔、表面具网状纹饰的Byttnerieae型。

   最后一支由Sterculieae族的Brachychiton和Scajphium两属构成，其bootstrap分析的支持强度为100%。该分支与Fremontodendron为并系，同样也间接地反映了Sterculieae和外类群（锦葵科）之间较为密切的联系。需要说明的是同属Sterculieae的Firmiana在本文的分支图中落入了上述的核心分支中，这一结果与我们依据rbcL序列资料所建立的分支图相同，反映了Sterculieae在进化上的不同步性。另外，F. simplex是中国特有种，而B. rupestris和S. lychnophorum均为外来引进种，或许这也是造成它们在DNA水平上发生分歧的原因之一。Sterculieae是梧桐科中分布最广、而属种数目仅次于Dombeyeae的大族。该族既具有单被、单性等进化特征，又具有分离心皮果实的原始特征，这类果实特征被认为是从分离心皮类型的祖先如番荔枝科Annonaceae和五桠果科Dilleniaceae直接保留下来的残余特征（徐颂军，徐祥浩，2001）。因此，该族在形态特征上具有最为丰富的多样性，是梧桐科内系统进化的主干线，也是连接较原始科（如番荔枝科、五桠果科和椴树科）与较进化科（如锦葵科）的中心纽带（Judd and Manchester，1997； La Duke and Doebley，1995；Thorne, 1992; Dahgren，1989；Takhtajan，1987；Cronquist, 1981，1988）。

   作为总结，我们不赞成依据一二个DNA片段的序列资料来对锦葵目包括梧桐科进行重新界定的做法，一方面是因为它们所提供的信息量十分有限，与庞大的基因组相比，它们仅仅是一二基因而已；与外部形态特征相比，它们所提供的信息量也明显不足，因为任何一个形态特征的建成也不可能是由一二个基因所能左右的。另一方面，从来自不同DNA片段的分支图来看，许多分类群的位置并不固定，毕竟不同的基因片段其进化速率是不同的，与形态特征的发展也不是完全平行的。再者，目前我们所使用的基因大多是单亲遗传的叶绿体基因，对杂种起源和网状进化事件的解释存在明显不足（汪小全，李振宇，1998）。另外，在DNA序列简约性分析中，某些分支会出现错误，这种情况至少在趋异比较大的类群中出现，而且没有其他信息可以帮助得知这些错误究竟出在何处（Olmstead et al., 1994；Chase et al., 1993）。因此，利用少数几个基因片段资料来对锦葵目包括梧桐科进行重新界定还是存在一些缺陷的，正如Alverson等（1999）自己所指出的那样，如果要进一步发展这一研究成果，还需要更多分类单元的取样和其他基因序列的证据，同时还要认真考虑来自形态学上的证据。然而，DNA片段的序列资料对于植物系统发育和亲缘关系的确立却能提供重要信息，尽管信息量有限，但毕竟是来自遗传物质本身，同时在取样不足时，一个或一些分类单元的错误位置还可能带来非常重要的系统发育含义（Olmstead et al., 1994）。另外，DNA片段资料对于一些疑难类群的归属问题也可提供重要证据。

致谢 本文在材料采集和实验过程中得到了华南植物园的韦强先生和深圳仙湖植物园的余鑫生先生的大力帮助，在此作者深表谢意。

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